Для выделения вирусов используют материал, в котором возможно наличие вируса (лизат бактерий, куски тканей животных, листья растений и т.д.). Материал в случае необходимости измельчают, гомогенизируют для того, чтобы в управляемых условиях перевести вирусы в суспендированное состояние.
Большинство вирусов животных выделяют из сыворотки крови. Аналогичного среды для выделения вирусов растений нет. Поэтому для выделения вирусов растений используют гомогенаты растительных органов, которые переносят в искусственную среду. Ряд факторов среды влияет на стабильность вирусов.
Следует помнить, что:
1. Многие вирусы стабильны лишь в узком интервале pH и при выделении вируса этот показатель среды не должен выходить за установленные пределы.
2. Часто используют фосфатные буферы, но иногда они могут быть непригодными и более эффективным может оказаться, например, боратный буфер.
3. Некоторые вирусы проявляют активность только при наличии ионов металлов (Са2+ или Mg2+). Важным фактором является ионная сила буфера. Вирус мозаики люцерны преципитирует при концентрации Mg2+> 0,001 М и деградирует при концентрации, превышающей 0,1 М.
4. Многие вирусы в условиях in vitro очень быстро теряют активность, очевидно, вследствие разрушения их РНК рибонуклеазы, поэтому очень часто к среде добавляют Mg-бентонит. При его наличии нуклеазного активность уменьшается до нуля.
Чтобы освободить экстракт от бактериальных инфекционных агентов можно использовать бактериальные фильтры, задерживающие линейные части, размеры которых составляют 0,5 мкм и более (крупнейший вирус достигает 0,8 мкм).
В случае выделения вирусов из разных тканей и гомогенатов лучшие результаты дают: дифференциальное центрифугирование, осаждение аммоний сульфатом, центрифугирования в градиенте сахарозы и цезий хлорида, обработки ферментами.
Суть дифференциального центрифугирования состоит в ряде центрифужных циклов с высокими и низкими скоростями, сменяющими друг друга. В результате центрифугирования при 20-50 тыс. Об/мин. вирусы и другие части выпадают в осадок. Затем полученный осадок суспендируют в буферном растворе и суспензию снова центрифугируют при 8-10 тыс. Об./мин. для удаления мембран и волокнистых компонентов клетки, денатурированных белков и т.д. Следующее центрифугирования при 30-50 тыс. Об./мин. снова приводит к осаждению вирусов. Двоабо трехкратное повторение такого цикла позволяет легко выделить СТМ и другие вирусы.
Иногда выгодно сочетать дифференциальное центрифугирование с высаливанием аммоний сульфатом. Для этого осадок неочищенного вируса суспендируют в воде, обрабатывают в растворах с растущими концентрациями аммоний сульфата. Когда появляется осадок, его отделяют центрифугированием при 8 тыс. Об./мин., а к супернатанта снова медленно добавляют аммоний сульфат, пока не образуется осадок, который вновь отделяют центрифугированием.
Очень ценным является метод очистки вирусов путем центрифугировании в растворах с возрастающей концентрацией сахарозы или глицерина (5-25%). С помощью полученного градиента сахарозы можно достичь хорошего разделения вирусов и их компонентов.Вместе с тем вирусы и их компоненты разделяются слоями, которые можно легко обнаружить, осветив пробирку. Слой, содержащий вирусы, не сложно отобрать с помощью шприца. Возможен еще и другой способ отбора вирусов из пробирки. Ного применяют в том случае, когда имеют дело с малыми концентрациями вируса. Для этого дно пробирки прокалывают и ее содержание начинает медленно вытекать. Его собирают в другие пробирки и уже в них определяют наличие вирусов.
